DNA SEBAGAI MATERI GENETIK

1. PERCOBAAN AVERY–MACLEOD–MCCARTY
Percobaan Avery–MacLeod–McCarty menunjukkan kepada masyarakat umum adanya bukti bahwa DNA dapat mentrasformasi bakteri. Avery–MacLeod–McCarty melanjutkan penelitian yang dilakukan oleh Frederick Griffith sebelumnya.
Tahun 1928, Frederick Griffith, seorang petugas kesehatan berasal dari Inggris yang mempelajari Streptococcus pneumoniae, yaitu bakteri yang menyebabkan penyakit pneumonia pada mamalia. Percobaan Frederick Griffith adalah salah satu percobaan pertama yang menunjukkan bahwa bakteri dapat memindahkan informasi genetik melalui proses yang disebut transformasi.

Berdasarkan sumber (http://sinaubiologi.files.wordpress.com/2010/11/dna-sebagai-materi-genetik.pdf), Griffith menggunakan dua galur Pneumococcus (yang menginfeksi tikus), galur tipe III-S dan tipe II-R. Galur III-S memiliki kapsul polisakarida yang membuatnya tahan terhadap sistem kekebalan inangnya sehingga mengakibatkan kematian inang, sementara galur II-R tidak memiliki kapsul pelindung tersebut dan dapat dikalahkan oleh sistem kekebalan tubuh inang. Dalam eksperimen ini bakteri galur III-S dipanaskan hingga mati, dan sisa-sisanya ditambahkan ke bakteri galur II-R. Meskipun tikus tidak akan mati bila terkena baik sisa-sisa bakteri galur III-S (yang sudah mati) ataupun galur II-R secara terpisah, gabungan keduanya mengakibat kematian tikus inang. Griffith berhasil mengisolasi baik galur pneumococcus II-R hidup maupun III-S hidup dari darah tikus mati ini. Griffith menyimpulkan bahwa bakteri tipe II-R telah tertransformasikan menjadi galur III-S oleh sebuah prinsip transformasi.
Prinsip pentransformasi yang diamati oleh Griffith adalah DNA bakteri galur III-S. Meskipun bakteri itu telah mati, DNA-nya bertahan dari proses pemanasan dan diambil oleh bakteri galur II-R. DNA galur III-S mengandung gen yang membentuk kapsul perlindungan. Dilengkapi dengan gen ini, bakteri galur II-R menjadi terlindung dari sistem kekebalan inang dan dapat membunuhnya.
Nah, penelitian Griffith tersebut menjadi titik awal bagi sebuah penelitian untuk mencari identitas substansi pentransformasi yang dilakukan oleh ahli bakteriologi Amerika Oswald Avery. Ia memurnikan berbagai macam zat kimia dari bakteri-bakteri patogenik yang telah dimatikan dengan panas, kemidian mencoba mentransformasikan bakteri nonpatogenik hidup dengan setiap zat kimia. Hanya DNA yang mampu melakukannya.
Pada percobaan Avery, MacLeod, dan McCarty mengkulturkan galur IIIS dalam jumlah volume yang besar, kemudian mengendapkannya dengan sentrifugasi dan mensuspensikannya kembali menjadi volume yang lebih kecil untuk memudahkan penanganan berikutnya. Sel-sel ini kemudian dimatikan dengan pemanasan. Setelah dilakukan pencucian dan ekstraksi dengan detergen, sebagian filtrat yang dihasilkan digunakan untuk transformasi dengan mencampurnya dengan sel hidup galur IIR. Ternyata filtrat ini masih mampu menginduksi transformasi. Sebagian filtrat lagi dibuang proteinnya, dan sebagian lagi dibuang polisakaridanya, dan sebagian lagi dibuang protein dan polisakaridanya. Filtrat-filtrat ini masih aktif menginduksi proses transformasi. Setelah pembuangan protein dan polisakarida, filtrat ini dipresipitasikan dengan etanol dan didapatkan benang-benang asam nukleat yang masih mempunyai kemampuan untuk menginduksi transformasi.
Untuk mengkonfirmasi hasil tersebut, filtrat dari sel IIIS yang telah dimatikan diperlakukan dengan protease (suatu enzim yang dapat menghancurkan protein), dan RNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan molekul RNA) secara terpisah, kemudian dicampur dengan sel galur IIR. Pencampuran ini masih menghasilkan bakteri galur IIIS, yang berarti bahwa protein dan RNA bukan merupakan bahan untuk transformasi (transforming principle). Percobaan lainnya adalah dengan menambahkan DNase (suatu enzim yang dapat menghancurkan enzim) pada filtrat dari sel IIIS. Filtrat yang telah dicampur dengan DNase ini ternyata tidak mampu menghasilkan sel IIIS bila dicampur dengan sel IIR, yang berarti tidak mampu menginduksi transformasi. Dari hasil percobaan ini, Avery, MacLeod, dan McCarty tidak ragu lagi untuk menyatakan bahwa DNA adalah bahan utama untuk transformasi.
Bahan utama untuk transformasi berinteraksi dengan sel IIR yang menimbulkan berbagai reaksi enzimatik yang berakhir dengan sintesis kapsul polisakarida tipe IIIS. Bila transformasi telah berlangsung, kapsul polisakarida akan disintesis terus pada generasi berikutnya, dan bahan utama untuk transformasi digandakan pada sel-sel anaknya. Oleh sebab itu transformasi merupakan proses yang mempengaruhi bahan genetik dan dapat diwariskan ke generasi berikutnya.
Akhirnya pada tahun 1944, Avery dan koleganya Colin MacLeod dan Maclyn McCarty mengumumkan bahwa agen pentransformasi tersebut adalah DNA. Oswald Avery, Colin MacLeod, dan Maclyn McCarty membuktikan bahwa DNA adalah material yang diturunkan yang dipunyai hampir semua organisme.

2. PERCOBAAN ALFRED HERSHEY DAN MARTHA CHASE
Percobaan yang dilakukan oleh Alfred Hershey dan Martha Chase merupakan suatu percobaan yang menunjukkan bahwa DNA merupakan bahan genetik. Mulanya, para ilmuwan menganggap bahwa suatu pembawa sifat ke generasi berikutnya adalah protein. Namun, dengan adanya percobaan yang dilakukan oleh Alfred Hershey dan Martha Chase ini membuktikan hal berbeda. Percobaan yang dilakukan oleh Hershey dan Chase ini juga menunjukkan bahwa DNA virus (dalam hal ini adalah virus Fag T2) dapat memprogram suatu sel (bakteri).
Hershey dan Chase menggunakan virus Fag T2 dalam percobaannya dengan bahan uji lainnya adalah bakteri E. Coli. Digunakannya virus Fag T2 karena virus ini telah diketahui sebelumnya mengenai strukturnya dengan menggunakan mikroskop cahaya biasa. Virus T2 ini juga merupakan virus yang menginfeksi bakteri E. Coli. Selain itu, virus ini bentuknya sederhana, yaitu terdiri atas cangkang protein yang berisi bahan genetik.
Metodenya adalah virus yang sama-sama dimasukkan kedalam suatu tabung reaksi atau alat uji dapat menginfeksi bakteri E. Coli dan menjadikannya sebagai inang atau perantara bagi pembiakan diri virus hingga tubuh virus dapat berlipat ganda dengan mengeksploitasi bakteri.
Percobaan yang dilakukan oleh Hershey dan Chase ini meliputi dua tahapan atau proses, yaitu tahap pertama dengan unsur fosfor-32 radioaktif (isotop radioaktif) sebagai indikator dan selanjutnya tahapan kedua yaitu dengan menggunakan belerang-35 radioaktif sebagai indikator. Singkat kata, percobaan Hershey dan Chase ini juga ingin membuktikan mengenai siapa yang bertanggungjawab atas pemrograman ulang tubuh inang untuk memproduksi virus dalam jumlah besar.
Protein (bukan DNA) mengandung unsur belerang dan unsure-unsur radioaktif yang digunakan dalam percobaan ini hanya masuk kedalam protein dari faga tersebut. Pada DNA dapat ditemukan unsur fosfor, dan unsur ini tidak ditemukan pada asam amino yang merupakan komponen dasar protein.

Hasil percobaan menunjukkan bahwa virus Fag T2 menyuntikkan bahan genetik berupa DNA kedalam tubuh inangnya dengan selubung proteinnya tetap berada diluar. Selanjutnya, DNA yang merupakan bahan genetik dari virus akan merusak kerja dari DNA bakteri E. Coli, sehingga DNA virus dapat mengendalikan kerja tubuh bakteri. Pengalihan perintah kerja oleh bahan genetik ini digunakan untuk memperbanyak jumlah DNA virus.
Para saintis dapat menemukan (pada percobaan dengan isotop radioaktif belerang) bahwa yang masuk kedalam tubuh inang hanyalah materi genetiknya (DNA) saja didasari pada pellet dan supernatant larutan tadi. Sebagian besar radioaktivitasnya ditemukan didalam supernatan yang mengandung partikel-partikel virus bukan bakteri.
Sebaliknya, pada percobaan dengan isotop radioaktif fosfor ditemukan paling banyak radioaktif adalah materi bakterial. Pada saat bakteri yang terinfeksi dilepasakan kembali kedalam medium kultur, tetap saja infeksi oleh virus terus terjadi dan E. Coli melepaskan Fag-fag yang mengandung sejumlah fosfor radioaktif.
Kesimpulannya, percobaan yang dilakukan oleh Hershey dan Chase membuktikan bahwa DNA virus masuk kedalam tubuh bakteri E. Coli, sedangkan sebagian besar protein virus tetap berada diluar. Masuknya materi genetik kedalam tubuh bakteri akan menyebabkan terjadinya kerusakan program genetik bakteri karena diambil alih oleh DNA virus. Hal ini menyebabkan virus dapat dengan mudah memperbanyak diri selama didalam tubuh bakteri. Percobaan Hershey dan Chase memberikan bukti kuat bahwa asam nukleat (bukan protein) merupakan materi hereditas.
3. PLASMID DAN EPISOM
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik.
Plasmid adalah material turun temurun yang tidak merupakan bagian kromosom, dapat memperbanyak diri sendiri, biasanya bulat, kecil, dan relatif sederhana tidak esensial bagi sel yang bersangkutan, dalam keadaan tertentu ada plasmid yang dapat menguntungkan sel yang dihuninya; banyak digunakan dalam percobaan-percobaan DNA rekombinan sebagai penerima DNA asing.
Episom adalah unsur-unsur genetika bebas, berupa virus atau jasad renik lainnya, yang telah dapat berkembang dalam sel bakteri baik dalam keadaan autonom (menggandakan diri dan dipindahkan tanpa bergantung kepada kromosom bakteri) maupun pada keadaan terintegrasi (melekat pada kromosom bakteri, berperan serta bersamanya dalam rekombinasi genetika dan dipindahkan bersama kromosom bakteri tersebut).
Episom adalah plasmid yang di satu waktu berada sebagai cincin-cincin DNA kecil yang independent, namun di waktu lainnya berada dalam keadaan terintegrasi dengan kromosom.
Plasmid mempunyai jumlah yang lebih banyak dari pada kromosom yang ada dimitokondria dan plastida, tapi mereka tidak teroganisir dalam bentuk suatu organel penting bagi sel induknya. Beberapa plasmid adalah suatu fragmen kromosom bakteri dan beberapa lagi merupakan fragmen DNA rekombinan. Sebagian besar plasmid tidak penting bagi sel induknya, tapi beberapa mempunyai kemampuan untuk reaksi antibiotik. Karena plasmid memiliki kemampuan untuk bereplikasi sendiri dan untuk berkombinasi dengan DNA lain dan untuk membawa DNA dalam pusat aktivitas sintetis sel, maka digunakan dalam teknik genetika.
Plasmid mempunyai ukuran yang sangat bervariasi. Mulai dari yang hanya membawa 3 gen sampai bentuk ukuran yang mampu menampung lebih dari beberapa ratus gen. Beberapa sel bakteri diketahui menyimpan sejumlah plasmid yang berbeda dengan isi kromosom utamanya. Plasmid diketahui berguna pada 2 fungsi utama yaitu:
1. Untuk memperbanyak berbagai macam antibiotik dan obat yang resisten terhadap bakteri patogen.
2. Untuk menstabilkan mikro organisme penting bagi perindustrian.
Sebagai contoh Streptococcus lactis dan beberapa bakteri yang digunakan dalam proses pembuatan keju. Beberapa plasmid sudah diidentifikasi dan menunjukkan bahwa plasmid-plasmid tersebut membawa gen-gen yang mengkode enzim-enzim penting dalam proses fermentasi pembuatan keju.
Tiga tipe plasmid bakteri yang sudah dipelajari secara mendalam adalah
1. F dan F’ plasmid, factor fertilitas konjugasi
2. R plasmid disebut juga RTF atau Resisten Transfer Factor plasmid membawa beberapa gen untuk resistensi terhadap antibiotic atau obat antibiotic yg lain.
3. Col plasmid disebut juga colicinogenic, plasmid yang mengkode untuk colisin, protein yang membunuh secara sensitive sel E. Coli (Gardner, 1991).
Plasmid F, terdiri dari sekitar 25 gen, sebagian besar diperlukan untuk memproduksi pili seks. Ahli-ahli genetika menggunakan simbol F+ untuk menyatakan sel yang mengandung plasmid F (sel "jantan"). Kondisi F+ dapat diwariskan: plasmid F bereplikasi secara sinkron dengan DNA kromosom, dan pembelahan satu sel F+ biasanya menghasilkan dua keturunan yang semuanya merupakan F+. Sel-sel yang tidak memiliki faktor F dibri smibol F- , dan mereka berfungsi sebagai resipien DNA ("betina") selama konjugasi. Kondisi F+ adalah kondisi yang "menular' dalam artian sel F+ dapat mengubah sel F- menjadi F+ ketika kedua sel tersebut berkonjugasi. Plasmid F bereplikasi di dalam sel "jantan”, dan sebuah salinannya ditransfer ke sel "betina” melalui saluran konjugasi yang menghubungkan sel-sel tersebut. Pada perkawinan F+ x F- seperti ini, hanya sebuah piasmid F yang ditransfer. Sel yang dilengkapi dengan faktor F dalam kromosomnya disebut sel Hfr (high frequency of recombination atau rekombinasi frekuensi tinggil). Sel Hfr tetap berfungsi sebagai jantan selama konjugasi, mereplikasi faktor F dan mentransfer salinannya ke F- pasangannya (Campbell, 2002).
Plasmid R, plasmid yang membawa gen resisten mengandung 1 atau lebih zat kimia. Adanya zat kimia tersebut yang mengandung racun bertujuan untuk melawan inveksi. Resistensi terhadap 1 atau lebih dari racun merupakan inveksi yang berguna untuk memblok atau menahan DNA marker, yang ditransfer selama konjugasi. R factor mengandung 2 bagian yaitu resistence transfer factor atau RTF yang bertanggung jawab untuk mentransfer berbagai macam sistron yang resisten terhadap obat-obatan yang terdiri dari faktor R.
R Faktor merupakan plasmid, yang memiliki rentan ukuran dari yang rendah yaitu 1,5 x 104, hingga yang tinggi yaitu 1 x 105 pasang DNA. Sebagian besar selalu ada dalam 1 hingga 3 kopi per sel, walaupun terdapat jumlah yang lebih besar pada beberapa R factor (George, 1983). Secara garis besar plasmid juga diketahui untuk mengkode bakteriosin tidak hanya colisin. Sebagai contoh adalah plasmid yang diketahui untuk mengkode fibriocins dimana protein tersebut dapat membunuh bakteri fibrio colera dan plasmid-plasmid tersebut tampak mirip dengan col plasmid.
Plasmid dapat dibedakan atas 2 kelompok berdasarkan apakah plasmid tersebut mediate konjugasi atau tidak. Berdasarkan kemampuan konjugasinya adalah plasmid F dan F’, banyak plasmid R dan beberapa plasmid Col. Konjugasi alami dari beberapa R plasmid sangat signifikan dalam kecepatan penyebaran kemampuan resistensi terhadap antibiotic dan obat melalui populalsi bakteri pathogen, untuk yang non konjugasi yaitu banyak plasmid R dan plasmid Col. Beberapa plasmid seperti F factor dapat didefinisikan sebagai episom. Episom adalah materi genetik yang dapat bereplikasi dengan 2 alternatif yang berbeda :
1. Tergabung dalam kromosom utama sel induk
2. Sebagai elemen genetik autosom, kromosom induk yang independent.
Tetapi bentuk dari plasmid dan episom tidak sama. Banyak plasmid yang ada dalam bentuk terintegrasi, demikian juga pada episom seperti banyak ditemukan pada gen episom tapi bukan plasmid.
Banyak penyusun plasmid dan episom yang diketahui tergantung pada sequence DNA pendek yg disebut IS elemen, atau disebut juga Insertion Sequence. IS elemen juga ada di dalam kromosom utama induk. Sequence DNA pendek tersebut (dari 800-1400 pasang Nukleotida) adalah transposibel, yang artinya IS elemen ini dapat bergerak dari 1 posisi ke posisi yang lain di dalam kromosom atau bergerak dari satu kromosom ke kromosom yg lain (Gardner, 1991).

4. ELEMEN TRANSPOSABEL
Elemen transposable adalah urutan DNA yang dapat berpindah dari satu tempat ke tempat lain (mengalami transposisi) di dalam suatu genom. Pada awal tahun 1940-an, peneliti telah menemukan kalau beberapa urutan DNA dapat berubah posisi. Urutan yang dapat berpindah ini disebut dengan elemen genetik yang transposabel atau singkatnya disebut transposon. Penelitian menunjukkan bahwa elemen ini ada pada prokariotik dan eukariotik
Elemen transposabel ini ditemukan oleh B. McClintock melalui analisa ketidakstabilan genetik pada maizena yang berkaitan dengan kerusakan kromosom dan ditemukan pada bagian dimana elemen transposabel ini berada. Pada analisa McClintock, kerusakan dideteksi dengan hilangnya penanda genetik tertentu. Pada beberapa eksperimen, McClintock menggunakan penanda yang mengkontrol deposisi pigmentasi pada aleuron, membran terluar dari endosperm biji maizena. Penanda tersebut adalah alel pada lokus C pada lengan pendek dari kromosom 9. Alel yang disebut CI ini, adalah inhibitor dominan dari pewarnaan aleuron sehingga biji yang memiliki alel ini akan menjadi tidak berwarna. McClintock memfertilisasikan bunga betina CC dengan polen dari bunga jantan CI CI, menghasilkan biji yang endospermnya CI CC. Walaupun banyak dari biji ini tersebut tidak berwarna, beberapa juga menunjukkan adanya pigmen ungu kecoklatan.
McClintock beranggapan bahwa alel inhibitor CI telah hilang beberapa saat selama pembentukan endosperm, sehingga klon dari jaringan yang dapat membentuk pigmen dapat muncul. Genotip dari klon ini kemungkinan adalah –CC dan yang hilang adalah alel CI . Analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa alel ini hilang akibat kerusakan kromosom. Kerusakan pada suatu lokasi akan melepaskan segmen kromosom dari sentromernya sehingga membentuk fragmen asentrik.
McClintock menemukan bahwa kejadian seperti ini secara berkala muncul akibat kerusakan bagian tertentu pada kromosom 9. Dia memberi nama faktor yang menyebabkan kerusakan ini Ds (disosiasi). Pada ekperimen tersebut, kromosom yang membawa alel CI juga membawa faktor Ds. Jika sendirian, faktor ini tidak mampu untuk mempengaruhi kerusakan kromosom. Ds diaktifkan oleh faktor lain yang disebut Ac (aktivator). Dua faktor inilah yang menyebabkan ketidakstabilan genetik pada kromosom 9.
Baik Ac maupun Ds adalah bagian dari elemen transposabel. Elemen ini secara struktur saling terhubung dan dapat memasuki lokasi berbeda pada kromosom. Ketika salah satu dari elemen ini masuk atau berada dekat sebuah gen, fungsi dari gen tersebut telah berubah. Bahkan fungsi dari gen tersebut bisa benar-benar hilang. Oleh karena itu, McClintock menyebut Ac dan Ds sebagai elemen pengontrol.
Kadang-kadang, mutasi yang diakibatkan oleh elemen kontrol ini tidak tetap. Sebagai contoh, salah satu mutasi dari lokus bronze yaitu bz-m2. Mutasi ini diakibatkan oleh insersi dari elemen Ac dan akan berbalik jika elemen Ac dihilangkan. Sedangkan mutasi yang lain yaitu bz-m1, disebabkan oleh insersi dari Ds. Namun reversi pada kasus ini hanya terjadi jika elemen Ac ada di bagian manapun pada genom. Inilah perbedaan dari kedua alel tersebut. Elemen Ac dapat aktif sendiri namun Ds tidak. Ketika suatu transposon dapat mengaktifkan dirinya sendiri, hal ini disebut berfungsi secara autonom, sedangkan jika tidak maka disebut nonautonom
Ketidakstabilan genetik juga dapat ditemukan pada bakteri dan pada kasus ini juga ditemukan adanya elemen transposabel. Transposon pada bakteri yang paling sederhana adalah rangkaian insersi atau elemen IS. Elemen IS yang homolog terkadang berkombinasi dengan gen lain untuk membentuk tansposon gabungan, yang ditandai dengan simbol Tn. Simbol ini juga digunakan untuk menandai transposon yang tidak mengandung elemen IS, seperti elemen yang disebut sebagai Tn3. Seperti halnya transposon gabungan, elemen ini juga mengandung gen yang yang tidak penting untuk transposisi.
Elemen IS merupakan elemen yang terorganisasi secara kompak, biasanya merupakan urutan sandi tunggal dengan urutan yang sama atau hampir sama dan pendek pada kedua ujungnya. Ujung urutan ini selalu berorientasi secara invert sehingga disebut inverted terminal repeat yang panjangnya berkisar antara 9 sampai 40 pasang nukleotida.
Ketika elemen IS masuk ke dalam kromosom atau plasmid, elemen ini membuat duplikat dari urutan DNA pada lokasi insersi. Hasil pengkopian dari duplikasi terletak pada masing-masing sisi dari elemen tersebut dan disebut sebagai duplikasi lokasi target. Elemen IS memediasi integrasi episome ke dalam kromosom bakteri.
Tansposon gabungan terbentuk ketika dua elemen IS saling menginsersi. Urutan ini dapat diubah oleh kerja sama dari elemen yang mengapitnya. Sebagai contoh, pada Tn9, elemen IS yang mengapit langsung berorientasi dengan yang lainnya sedangkan Tn5 dan Tn10 berorientasi terbalik. Masing-masing transposon gabungan ini membawa gen yang resistan terhadap antibiotik. Tn9 resistan terhadap chloraphenicol, Tn5 resistan terhadap kanamycin dan Tn10 resistan terhadap tetracycline. Hal ini menunjukkan bahwa kadang elemen IS pengapit pada transposon gabungan tidak identik. Pada Tn5, elemen yang terletak di kiri, disebut IS50L tidak mampu untuk menstimulasi transposisi namun elemen yang berada di kanan yaitu IS50R mampu melakukannya. Perbedaannya adalah perubahan pasangan nukleotida tunggal menghalangi IS50L untuk mensintesis faktor transposisi yang penting. Faktor ini merupakan protein yang disebut transposase yang disintesis oleh IS50R.
Sedangkan Tn3 merupakan elemen dari kelompok transposons yang memiliki ulangan ujung terbalik sepanjang 38-40 pasang nukleotid, lebih besar daripada elemen IS dan biasanya mengandung gen yang dibutuhkan untuk transposisi. Transposisi pada Tn3 berlangsung dalam dua tahap. Tahap pertama adalah transposase memediasi penggabungan antara dua molokul sehingga membentuk struktur yang disebut cointegrate. Selama proses ini, transposon mengalami replikasi dan masing-masing membentuk sambungan pada cointegrate. Pada tahap kedua, pengkode tnpR memutuskan mediasi rekombinasi pada lokasi yang spesifik antara dua Tn3 elemen. tahapan ini muncul pada urutan di Tn3 yang disebut res, lokasi resolusi, dan menyebabkan timbulnya dua molekul, masing-masing dengan kopian dari transposon.